Coloration de Gram : principe, étapes et interprétation (Gram+ / Gram−)
Coloration de Gram : principe, étapes et interprétation
La coloration de Gram sépare les bactéries en deux groupes selon la structure de leur paroi. Après quatre étapes — cristal violet, Lugol, décoloration à l'alcool, contre-coloration à la fuchsine — les bactéries à Gram positif apparaissent violettes et les bactéries à Gram négatif apparaissent roses. La raison tient en une phrase : la paroi épaisse de peptidoglycane des Gram+ retient le complexe cristal violet–iode pendant la décoloration, alors que la paroi fine des Gram−, surmontée d'une membrane externe riche en lipides, le laisse s'échapper.
C'est la première manipulation de tout TP de microbiologie et la première information que demande un clinicien devant une infection. Ce cours reprend le principe, le protocole détaillé, l'interprétation, les erreurs classiques et les exceptions. Il complète notre cours sur les différentes formes de bactéries.
Le principe : tout se joue dans la paroi
Les deux types de parois ne diffèrent pas par leur nature chimique mais par leur architecture.
Chez les bactéries à Gram positif, le peptidoglycane (ou muréine) forme une couche massive de 20 à 80 nm, traversée d'acides téichoïques et d'acides lipotéichoïques. Il n'y a pas de membrane externe : la paroi est un maillage dense directement exposé au milieu.
Cette architecture n'existe que chez les procaryotes : voir notre cours sur les différences entre cellule procaryote et cellule eucaryote.
Chez les bactéries à Gram négatif, le peptidoglycane ne fait que 2 à 7 nm et se trouve coincé dans l'espace périplasmique, entre la membrane plasmique et une membrane externe particulière, dont le feuillet externe est constitué de lipopolysaccharides (LPS). Ce LPS est aussi l'endotoxine responsable du choc septique.
Pendant la coloration, le cristal violet pénètre dans toutes les cellules. Le Lugol (iode-ioduré) joue le rôle de mordant : il forme avec le cristal violet un complexe volumineux, peu soluble, piégé dans le cytoplasme. Vient alors l'étape décisive, la décoloration à l'alcool. L'alcool dissout les lipides de la membrane externe des Gram− et ouvre des brèches : le complexe s'échappe, la cellule redevient incolore. Chez les Gram+, l'alcool déshydrate au contraire le peptidoglycane, resserre son maillage et enferme le complexe. La fuchsine (ou la safranine) recolore ensuite en rose les seules cellules devenues incolores.
Schéma : paroi et déroulement de la coloration
Le protocole, étape par étape
Préparation du frottis
Déposer une goutte d'eau physiologique sur une lame propre, y émulsionner une colonie prélevée à l'anse stérile, étaler en couche mince, laisser sécher à l'air puis fixer à la chaleur en passant trois fois la lame dans la flamme. Un frottis trop épais est la première cause d'échec : les amas de cellules ne se décolorent pas uniformément.
1. Cristal violet — 1 minute
Recouvrir le frottis, laisser agir une minute, rincer à l'eau. Toutes les bactéries sont alors violettes.
2. Lugol — 1 minute
Le mordant forme le complexe cristal violet–iode. Rincer à l'eau. Les cellules restent violettes.
3. Décoloration à l'alcool — 10 à 30 secondes
C'est l'étape qui décide du résultat, et la seule qui soit chronométrée au sens strict. Verser l'alcool à 95° goutte à goutte jusqu'à ce que le filtrat soit incolore, puis rincer immédiatement à l'eau pour arrêter l'action. Un alcool laissé trop longtemps décolore aussi les Gram+ ; trop peu, et les Gram− restent violettes.
4. Contre-coloration à la fuchsine — 1 minute
La fuchsine diluée, ou la safranine selon les protocoles, recolore en rose les bactéries devenues incolores. Rincer, sécher, puis observer à l'objectif à immersion (×100).
Interprétation et principaux genres
Au microscope, on note simultanément trois caractères : la couleur, la forme (coque ou bacille) et le mode de groupement (amas, chaînettes, diplocoques).
- Cocci à Gram positif en amas : Staphylococcus.
- Cocci à Gram positif en chaînettes : Streptococcus.
- Diplocoques à Gram positif en flamme de bougie : Streptococcus pneumoniae.
- Bacilles à Gram positif : Bacillus, Clostridium, Listeria, Corynebacterium.
- Bacilles à Gram négatif : entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella), Pseudomonas.
- Diplocoques à Gram négatif : Neisseria (méningocoque, gonocoque).
L'enjeu dépasse l'exercice de laboratoire. Le résultat du Gram oriente l'antibiothérapie probabiliste dès la première heure, avant toute identification : les β-lactamines, qui bloquent la synthèse du peptidoglycane, et les glycopeptides comme la vancomycine, trop volumineux pour franchir la membrane externe, sont actifs essentiellement sur les Gram+. Cette logique est détaillée dans notre cours sur les infections nosocomiales.
Les exceptions à connaître
- Les mycobactéries (Mycobacterium tuberculosis) ont une paroi riche en acides mycoliques, cireuse : elles prennent mal le Gram. On utilise la coloration de Ziehl-Neelsen, qui les révèle comme bacilles acido-alcoolo-résistants.
- Les mycoplasmes n'ont pas de paroi du tout : ils sont invisibles au Gram, et naturellement résistants aux β-lactamines.
- Les cultures âgées de Gram+ se décolorent facilement et apparaissent Gram-variables. Toujours travailler sur une culture jeune de 18 à 24 heures.
- Les spirochètes (Treponema, Leptospira) sont trop fins pour être vus : on les observe au fond noir ou après imprégnation argentique.
Pour aller plus loin
- Les différentes formes de bactéries
- Cours : le métabolisme bactérien
- Principes des techniques de biologie
- Microbiologie et immunologie : exercices
- La fièvre typhoïde
FAQ — questions fréquentes sur la coloration de Gram
Pourquoi les bactéries à Gram négatif sont-elles roses ?
Parce qu'elles ont perdu le violet. L'alcool dissout les lipides de leur membrane externe et leur fine couche de peptidoglycane ne retient pas le complexe cristal violet–iode. Devenues incolores, elles ne prennent que la fuchsine appliquée ensuite, qui est rose.
Quelle est l'étape la plus importante ?
La décoloration à l'alcool. C'est la seule étape différentielle : avant elle, toutes les bactéries sont violettes ; après elle, le résultat est déjà joué. C'est aussi la source quasi exclusive des erreurs.
À quoi sert le Lugol ?
C'est le mordant. L'iode se lie au cristal violet et forme un complexe volumineux et peu soluble, beaucoup plus difficile à extraire que le colorant seul. Sans Lugol, la décoloration emporterait la couleur de toutes les cellules.
Peut-on remplacer la fuchsine par la safranine ?
Oui. Les deux sont des contre-colorants roses à rouges. La safranine est courante dans les protocoles anglo-saxons, la fuchsine diluée dans les protocoles francophones. Le résultat se lit de la même façon.
Que signifie « Gram variable » ?
Que la lecture n'est pas homogène : certaines cellules apparaissent violettes, d'autres roses. Cela traduit presque toujours un problème technique — culture trop vieille, frottis trop épais, décoloration mal maîtrisée — plutôt qu'une propriété de l'espèce. Il faut recommencer sur une culture jeune.
Qui a mis au point cette coloration ?
Le médecin danois Hans Christian Gram, en 1884, alors qu'il cherchait à mieux distinguer les bactéries dans des coupes de poumon. Il considérait sa méthode comme imparfaite et l'a publiée avec prudence ; elle est restée la technique la plus utilisée en bactériologie depuis plus de cent quarante ans.
Le Gram permet-il d'identifier l'espèce ?
Non. Il donne une orientation — couleur, forme, groupement — qui suffit à classer la bactérie dans un grand groupe. L'identification précise demande la culture sur milieux sélectifs, des tests biochimiques, et aujourd'hui souvent la spectrométrie de masse MALDI-TOF ou le séquençage de l'ARNr 16S.
Sources : Madigan M. T. et al., Brock Biology of Microorganisms, 16e éd., Pearson, 2021, chap. 2 ; Gram H. C., « Über die isolirte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten », Fortschritte der Medizin, 1884, 2:185-189 ; Silhavy T. J., Kahne D. & Walker S., « The bacterial cell envelope », Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2010, 2(5):a000414 (épaisseurs du peptidoglycane).
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